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转基因动物的研究进展

发布时间:2019-06-09 09:45:05 编辑:笔名

转基因动物的研究进展

21世纪将是生命科学突飞猛进的时代,生命科学将在人类生活中占有极突出的位置。一是生命科学的发展促进了其他学科的发展;二是生命科学发展带动的产业将推动世纪经济的发展。医学和药物学是人类健康的有力保障,农牧生物学可以极大提高农业和畜牧业产品的数量和质量,为人类提供丰富的衣食之源。利用转基因动物技术既可以加快定畜品种的改良速度,提高肉、奶、蛋的产量和品质,又可生产珍贵的药物蛋白,为大量患者造福。可以说转基因动物技术对人们千百年来追求的丰衣足食,延年益寿两大目标都将作出巨大贡献。

一、转基因动物的研究概况

1、转基因动物的定义1980年,耶鲁大学的Gordon等将一种新的基因通过受精卵原核徽注射的方法导入小鼠受精卵原核,被导入新基因的受精卵经胚胎移植后所获得的后代小鼠携带了导入的新基因。1983年,Gordon和Ruddle将这种携带了新基因(外源基因)的动物称为转基因动物,这是学术界首次使用这一术语。1987年华盛顿大学Palmiter在Gordon等人的基础上,对转基因动物进行了具体的定义:“转基因动物”是指那些通过使用实验手段将外源基因导入动物的生殖细胞,由导入外源基因的生殖细胞发育的个体整合了外源基因,整合的外源基因又能向其后代遗传的动物。Palmiter对转基因动物的定义自然比Gordon等所给的定义更加具体完善,但根据这一定义,那些通过正常遗传而获得父母已整合外源基因的子代就不能被称为转基因动物。近年来,由于克隆技术发展迅速,转基因动物可由克隆转基因培养细胞(如ICM细胞,胎儿甚至成年动物成纤维细胞)而不必将外源基因导入生殖细胞而建立。因此“将携带了外源基因并能表达和遗传的动物,称为转基因动物”。这一定义更具普遍性。

2、转基因动物研究所况 转基因动物的现代研究是进入80年代以后,Gordon(1980)首先采用受精卵原核注射方法,将疱疹病毒基因,SV40DNA段和PBR322原核DNA分别注射到小鼠原核期胚胎的原核内,获得了相应的转基因小鼠。紧接着有人以同样的方法将兔B-珠蛋白基因,人工B-珠蛋白基因和疱疹病毒核苷酸基因,小鼠MT启动子与疱疹病毒腺苷酸基因的融合结构导入小鼠受精卵原核,获得了转基因小鼠。1982年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因(RGH)导入小鼠受精卵,得到21只小鼠,其中7只带有目的基因,有6/7的小鼠比同窝对照组生长快近两倍,这些快速生长的转基因小鼠被誉为“超级小鼠”(Super mouse),这一系列具轰动效应的结果起码实验性地证实两点(1)融合基因可以在宿主体内得到有效正确表达;(2)表达产物可以在宿主动物内行使功能。一系列成功引起众多研究者对培育转基因经济动物的极大兴趣,按照研究转基因小鼠的思路,转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊及转基因牛都陆续育成。在我国,上海生物所用显徽注射法将HBgAg-乙型肝炎表面抗原基因转移至兔胚胎,获得转基因兔。中国科学院发育生物学研究所与扬州大学合作,将EPO基因(促红细胞生成素)和人乙型肝炎表面抗原基因(HbsAg)导入山羊,获得了两种乳腺特异性表达的转基因山羊。

3、动物乳腺生物反应器 1985年Lovell-Badge次提出利用乳腺生物反应器生产重组蛋白质,所谓动物乳腺生物反应器就是利用乳腺特异表达的启动子构建表达单元,制作转基因大家畜,以期大家畜乳腺表达分泌特定重组蛋白。就通过转基因动物(家禽)来生产基因药物而言,理想的表达场所是乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官,乳汁不进入体内循环,不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。从转基因动物乳汁中获取的基因产物不但产量高,易提纯,而且表达的蛋白经过充分的修饰加工,具有稳定的生物活性。自1987年Gordon将人组织纤维溶酶原激活剂(tpA)cDNA与小鼠乳清酸蛋白((WAP)基因启动区构建融合表达结构,首建乳腺生物反应器小鼠模型,至今10年时间,人a-抗胰蛋白酶、人尿激酶等诸多重要蛋白质已得到有效表达。

我国对动物乳腺生物反应器的研究颇为重视,施履吉院士早在80年代就提出乳腺生物反应器构想,并与他人合作成功地获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。90年代,因家“863”高技术计划已将转基因羊-乳腺生物反应器的研究列入重大项目,并取得一系列可喜成果,中国科学院与场州大学合作获得促红细胞生成素和人乙肝炎表面抗原基因两乳腺特异表达的转基因山羊。1998年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得表达人凝血因子IX转基因山羊。

据国外经济学家预测,大约10年后,转基因动物生产的药品就会鼎足珩世界市场。那时单是药物的销售额就超过250亿美元(还不包括营养蛋白和其他产品),因此,利用转基因动物-乳腺生物反应器来生产药物和贵重蛋白,具有极大的潜力和广阔的前景,理所当然地成为今生物技术研究开发领域生命力的热点之一。

二、制备转基因动物的一般方法

在转基因动物研究的近20年时间里,研究者们先后探索的转基因方法有十几种,但迄今为止,较为成熟的方法并不多。要想高效率地获得转基因动物,如何转运目的基因是一个重要环节,从已有报道材料来看,有关转基因方法归纳起来大体有以下几种:

1、原核徽注射法 外源基因徽注射法(Microinjection)的创始人是Jaenish(1974),当Palmiter利用此法获得快速生长的“超级小鼠”后,这一转基因方法被广泛使用,其主要步骤包括:公母畜交配(或通过人工授精)获得原核期受精卵,将上源DNA通过徽注射导入原核中(一般是雄原核,然后将徽注射后的受精卵移入受体输卵管中继续发育。

2、反转录病毒载体法 反转录病毒(Retroviruses)作为转基因载体是目前应用较成功的一种基因转移方法,主要是利用反转录病毒的LTRs(长末端重复序列)区域具有转录启动子活性这一特点,将外源基因连接到LTR下部进行重组后,再使之包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。

3、胚胎干细胞介导的基因转移 胚胎干细胞(ES细胞,Embryo stem cell)是指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞,这种细胞具有类似癌细胞无限繁殖和高度分化的潜能,将目的基因转移入ES细胞重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES细胞进行克隆,可培育转基因个体。目前,胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟,在大动物上应用较晚。Piedrahita等(1988)从猪胚胎中获得了干细胞克隆系,Sitce和Strelchenko等获得牛的胚胎干细胞。尽管建立大家畜ES细胞系仍很困难,ES细胞介导法转基因仍是一条极具魅力的技术路线,随着一些相关关键技术的成熟,ES细胞介导法转基因仍是一条极具魅力的技术路线,随着一些相关关键技术的成熟,ES细胞介导法将会在转基因动物的研究中起到更加重要的作用。

4、精子载体法 这是一种直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法。精子直接与外源DNA混合培养,外源基因可以进入精子头部,受精后能发育成转基因动物,但其整合率低(鸡为6.0%),表达率高达50%。许多因素影响DNA与精子结合。较长的DNA片段7kb比较短的DNA片段(150——750dp)更容易被精子所摄取。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNA的结合率。目前已采用阳离子脂质体介导法,该脂质体借静电作用吸附于细胞表面,通过与细胞膜融合,细胞内吞而将结合的基因导入细胞,并获得表达。

5、YAC介导的基因转移 酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome,简称YAC)能克隆百万对碱基的大片段DNA。其技术途径有二:一是ES细胞转染YAC后体外筛选,阳性ES细胞囊胚腔注射;二是YAC的原核徽注射。此法具有以下优点:(1)保证大片段DNA的完整性;(2)保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高;(3)因保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应,因此,YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。

6、胞质内精子徽注射介导的转基因 鉴于精子载体法存在较大争论,Anthony等(1999)尝试一种新方法:预先将小鼠精子进行破膜处理,与编码绿色荧光蛋白GFP或B-半乳糖苷酶报道分子的外源DNA短时间(1min)共孵育,然后徽注射入减数分裂II期的卵母细胞质中,取得64%——94%转基因表达胚胎,并揭示精子与外源DNA在注射前已结合。将转GFP的胚胎移植,20%的后代表现为基因整合,此项研究揭示,精子膜经冷冻干燥或解冻处理后,外源DNA可穿过外膜,吸附于内膜。因此外源DNA能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞,经膜处理的携外源DNA精子的徽注射是一种有效的转基因手段。

除上述几种常用的转基因方法外,人们为了适应于一些特殊需要也探索一些其他的方法,如畸胎瘤细胞介导法、受体介导法、电激法、染色体片段显徽注射法、高效徽弹法等,但均因不太成熟不能广泛使用。综上所述,虽然目前使用的制备转基因动物的方法也不少,但总体看来,仍不是十分理想,效率较低。其中原核注射法是常用和获得转基因动物我的经典方法,反转录病毒载体法在禽类基因转移上应用较多,效果较好。受体介导法,畸胎瘤细胞介导法在基因治疗上有重要价值;经膜处理精子胞浆徽注射法结合了原核徽注射和精子载体法各自的长处;ES细胞介导法是和基因定位整合相结合的方法,可以克服外源基因随机整合所带来的一些弊端,而且可在体外条件下对外源基因的表达进行筛选。

三、转基因的整合与表达

1、外源基因在宿主染色体中的整合 从现有结果看,转基因的整合效率与注射DNA的浓度,注射DNA的结构形式(黏端、平端、超螺旋)以及卵细胞的来源都有一定关系,大约1ng/u1的DNA浓度,黏端DNA片段及采用杂种F1代鼠卵细胞是比较合适的做法。关于外源DNA被注入原核后,大致会发生如下过程,即外源DNA在核内DNA酶的作用下,通过简单的连接和同源重组机制整合到宿主染色体缺口上,这种整合可能发生在出现缺口或重组热点区域。目前要进一步提高整合效率,一方面要加强基础理论的研究,如果能对外源基因的整合机理有清楚系统的认识,则提高整合效率指日可待,但这种理论进步决非朝夕之功。另一方面,继续探讨更完善的转基因方法,利用胚胎干细胞介导可进行基因表达的体外筛选,因此此法是提高转基因效率潜力的方法。但鉴于目前的技术水平限制,许多动物种胚胎干细胞系建立还相当困难。Pinkert(1997)提出用哺乳动物细胞线粒体DNA构建表达栽体,细胞质注射,可避免外源基因在染色体组上的随机插入,及插入引起的一系列不利于胚胎技术存活的后果,而且线粒体遗传一般表现为单一的细胞质遗传,可使外源基因在后代的遗传中更为稳定。

2、外源基因的表达 转基因动物在不同实验室表达率相差很大,如B-珠蛋白的转基因研究中7个实验室表达率(表这的动物/总阳性动物)分别为0%、18.7%、22%、40%、70%、75%、100%。从基因到蛋白是一个多因素作用的生化过程,尤其是对随机插入宿主染色体的外源基因,其表达与否或表达程度强弱除受其本身结构影响外,整合位点的位置及附近顺式调控元件的有无都对外源基因表达产生影响。

外源基因表达很大程度上受整合位点的影响,所谓“位置效应”即是因整合位点不同而导致的基因表达差异。对位置效应直接的解释是插入位点附近的序列特点影响了其表达的程度,比如,如果外源基因插入转录失活的异染色质区域,则外源基因的表达有可能受到完全抑制。YAC介导的转基因,因保证了目的基因上下游侧翼序列的完整性,可一定程度上减弱位置效应。

3、提高外源基因表达效率的徽略 表达障碍或者说表达效率的不可预见性是困扰转基因研究的一个难题,促使研究者灵找针对性地解决表达效率低下的方法。当然选择启动子及基因结构对其整合后的表达至关重要。除此以外,对“位置效应”有缓解作用的特殊DNA序更的研究和基因共转移的探索是目前的热点。

转基因技术的诞生是科学发展史上的一大创举,它标志着人类对生物遣传物质的工作操作已进入一个崭新阶段。在21世纪转基因技术对生命科学内各种基本理论的探索作用越来越大,且具有巨大的商业价值。然而,从小至单个的结构基因,大至整个生物体是一个极端复杂的有机体,现有的实验还不足以完善转基因所涉及的理论。因此,充分利用转基因技术的潜在价值,实现转基因技术实用化、商业化、转基因动物的产业化,是新世纪生物科学工作者的努力目标。

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